在做Western blot时候，你可能有过这样的经历，膜不是一片黑就是一片白，明明目的条带只有一个，可是每次跑蛋白都能跑出好几条，有的离目的条带比较远相对好认，但有的离目的条带特别近，如果正好此处没有marker就更难认了，这里给小伙伴们盘点下这些Western Blot问题究竟是什么原因造成的，方便大家找出自己的目的蛋白。

目的条带好多个
1.抗体特异性不够
这里注意查看抗体说明书，有的抗体可以识别同源性的蛋白，如果你的目的条带只有其中一条，可以查看两种蛋白相对分子量的大小从而确定位置，比如下面这两个蛋白，1的分子量是76，2的分子量是82，从而可以确定上面的是2下面的是1。

先看看抗体：

再看应用部分就可知这个抗体既可以识别GSK3α在Tyr279的磷酸化，也能识别GSK3β在Tyr216位的磷酸化，抗体孵育结果如下，出来多条：

为了确定目的蛋白，洗去抗体再孵总蛋白GSK3β，结果如下，从而可以确定pGSK3β Tyr216的目的条带是位于下面的那条。

2.同种蛋白
一种蛋白经过酶的剪切之后，抗体既能识别剪切前的也能识别剪切后的，但是这里需要注意了，虽然孵出了两个蛋白，但这两种目的蛋白的曝光条件可能不一样，笔者所做的两个蛋白，2min短曝显示的是酶剪切前的蛋白，剪切后的蛋白曝光条件为10min长曝。

3.二聚体/三聚体
如果你的目的蛋白分子量是80kd左右，跑出来的一张膜上在150、200kd分子量的marker附近位置处也显示有条带，那么可能的原因就是蛋白发生了二聚体/三聚体化。

4.前期（裂解、提取、煮蛋白等）操作不当导致蛋白降解或部分降解
裂解时没有加入足够的蛋白酶或磷酸酶抑制剂、裂解后没有及时放在冰上，长时间暴露于室温下、煮蛋白不充分等等都可以导致蛋白降解，很典型的一个现象就是电泳、转膜条件等都无误的情况下膜上出现数条条带且无法分辨目的蛋白，连内参也是这样子，就只能重新提蛋白再做了。以下图为例，可能的原因是蛋白降解了一部分，未降解部分仍然可以和抗体结合就导致了多条带的发生。

如果内参条带十分好看，就只有目的蛋白出现这种情况，在排除抗体的原因后可能是裂解液出现了问题，可尝试着更换裂解液。

5.目的蛋白就是这么多条带
不要总怀疑自己，跑出了好多条带，自己也懵了，没关系，可能目的蛋白就是这么多，如果少了反而不正确了，给大家看一个例子：

6.是目的蛋白，但位置稍有变动
举个栗子，过表达一个蛋白，这个外源性的蛋白带有荧光基团或Flag，因为有了这些的“重量”，目的条带出来时会比内源性表达的位置稍微靠上。

我们再来说说有marker但膜一片黑的情况