细胞的健康状态是影响病毒产量的最关键因素。因此，我们一般我们选择293T细胞（稳定表达Large T antigen大T抗原版本）作为包装宿主。

用于慢病毒包装的293T细胞的传代数不宜过高。当我们从ATCC或其他正规细胞库购得细胞后，将复苏并培养的那一代记为第1代（暂时不管之前ATCC到底传了多少代）。在扩增培养、冻存及后续复苏使用时，务必记录传代数。在我手里用于包装慢病毒的293T，通常都在第6代左右，到第15代包装出来滴度并未有显著下降，但并没有测试过更高的代数。

这里我们定义，那个包含我们要表达的外源基因的质粒为transfer plasmid。大家应该已经清楚，transfer plasmid容纳外源基因长度的能力是有限的。尽管理论上，在LTR之间可以插入的基因长度约为8.5 kb，但超过3 kb就会导致包装效率降低。而整个质粒过大，也会导致转染效率降低，进而影响最后的滴度。插入片段的大小，是我们不能控制的，但我们可以尽量选择较小的transfer plasmid骨架（如无必要，不要携带其他元件如GFP等）。

包装慢病毒，除了transfer plasmid之外，我们还需要envelope plasmid和packaging plasmid。对于Envelope plasmid，通常我们选择VSV-G，因为含有这个包膜蛋白的慢病毒可以感染多种宿主。而packaging plasmid的基本构成为Gag，Pol，Rev和Tat。每一个组件的功能，可以在本文最后的附录表格中查到，但现在先来重点看一下Tat。

慢病毒是一种血源性病原体（要知道，人类免疫缺陷病毒，即HIV也是一类慢病毒）。为了将其改造成实验工具，科学家将慢病毒的包装和表达组件减少到最低程度。目前我们所能接触到的实验用慢病毒，由于至少需要3个质粒才能生产出来（即第二代慢病毒系统），因此成品慢病毒都不再具备生产子代病毒的能力。而为了进一步提高安全性，怕万一不小心真的见鬼了（即使几率低到不可思议），目前还有第三代慢病毒系统。它除了将packaging plasmid拆成几个之外，还对5’-LTR进行改造，从而进一步抛弃了Tat组件。

然而，抛弃Tat组件是有代价的。即使采用了嵌合LTR的第三代transfer plasmid，一旦缺少了Tat，同样会导致滴度降低。具体请看这篇文章的数据（也就是创造第三代慢病毒的文章）：其中pHR2是第二代质粒，在无Tat的情况下，滴度降低了一个数量级。而即使使用了第三代的pRRL质粒，缺少了Tat，滴度依然显著降低（虽然滴度近5 Million/ml，已经是非常高的了）。

和其他生物制品一般，保证慢病毒的稳定性也是至关重要的因素。慢病毒是在37℃细胞培养环境中包装的。根据现有的认识，慢病毒在37℃溶液的半衰期不超过12小时，甚至有文献报道仅有6小时左右。由此可见，我们有必要从延长半衰期入手。

与此同时，Broad Institute的The RNAi Consortium的方案也显示，使用30% FBS或者额外添加终浓度1%的BSA，能够显著提高病毒滴度。从经济的角度而言，对于慢病毒粗制品，我们完全可以选择BSA方案，因为粗制品中已经含有携带脂类的FBS，我们只需提高整体蛋白浓度。

附录

来源https://www.addgene.org/viral-vectors/lentivirus/lenti-guide/